System SNEDDS z olejem z czarnuszki – nowa nadzieja dla stabilności ramiprilu

Czym jest ramipril i jak wpływa system SNEDDS na jego działanie?

Ramipril, inhibitor enzymu konwertującego angiotensynę (ACE), odgrywa kluczową rolę w terapii nadciśnienia tętniczego i niewydolności serca. Jako prolek w postaci estru etylowego, ramipril ulega enzymatycznej konwersji do aktywnej formy – ramiprilatu, co jest niezbędne dla jego działania terapeutycznego. Utrzymanie stabilności chemicznej jest kluczowe dla zapewnienia odpowiednich stężeń leku w organizmie. Ramipril wykazuje niestabilność w warunkach hydrolizy kwasowej, obojętnej i zasadowej, co wskazuje na znaczącą degradację w rozpuszczalnikach o różnym pH, szczególnie w środowisku zasadowym. Ta niestabilność podkreśla potrzebę opracowania skutecznych strategii formulacyjnych zapewniających odpowiednią ochronę substancji.

Płynne samonanoemulsyfikujące systemy dostarczania leków (SNEDDS) zazwyczaj oferują zwiększoną rozpuszczalność i biodostępność doustną. Wynika to z ich zdolności do tworzenia nanoemulsji po rozproszeniu, co może ułatwić lepsze wchłanianie leku in vivo. Jednakże, stałe SNEDDS mogą zapewniać lepszą stabilność chemiczną i lepszą współpracę pacjenta. W przeciwieństwie do tego, chociaż formulacje płynne zapewniają natychmiastowe korzyści solubilizacyjne, mogą one stwarzać ograniczenia, takie jak niższa stabilność i wyższe koszty produkcji, co może ograniczać ich praktyczne zastosowanie.

Zarówno płynne, jak i stałe formulacje SNEDDS znacząco zwiększały rozpuszczalność i stabilność ramiprilu (RMP). Płynne SNEDDS utrzymywały stabilność termodynamiczną, a zoptymalizowane formulacje wykazywały rozmiary kropel w nanoskali, zapobiegając wytrącaniu się leku i rozdzielaniu faz. Ponadto, nanoemulsje wykazały zwiększoną stabilność ramiprilu poprzez zmniejszenie szybkości degradacji, szczególnie przy pH 5,0, co skutkowało najmniejszą degradacją w ciągu 180 dni. Stałe SNEDDS (S-SNEDDS) dodatkowo poprawiały stabilność RMP poprzez ograniczenie jego degradacji w płynnych formulacjach SNEDDS podczas przechowywania.

Badania wskazują, że olej z czarnuszki (BSO) i jego bioaktywny składnik tymochinon (THQ) wykazują znaczące działanie przeciwnadciśnieniowe, głównie dzięki właściwościom antyoksydacyjnym i przeciwzapalnym. Badania kliniczne wykazały, że suplementacja BSO może prowadzić do znacznego obniżenia zarówno ciśnienia skurczowego, jak i rozkurczowego, a także poprawy profilu lipidowego, co dodatkowo potwierdza jego rolę w zdrowiu układu sercowo-naczyniowego. Te odkrycia skłoniły do badania włączenia tych związków do produkcji samonanoemulsyfikujących systemów dostarczania leków zawierających ramipril (RMP-SNEDDS), aby potencjalnie wzmocnić przeciwnadciśnieniowe i kardioprotekcyjne efekty formulacji. Niedawne badanie RMP SNEDDS załadowanego BSO wykazało dobrą wydajność rozpuszczania. Jednakże, badanie to ujawniło również znaczącą degradację RMP w formulacji SNEDDS po 8 dniach przechowywania w warunkach przyspieszonych. Według najnowszych badań, sugerowany mechanizm degradacji obejmował hydrolizę amidu, hydrolizę estru alkilowego i laktamizację aminokwasu lub pochodnej. Te ograniczenia stabilności stanowią krytyczne wyzwanie dla obecnych formulacji RMP, które wymagają dalszych badań. W tym kontekście, obecne badanie wprowadza nowatorski wielowarstwowy system SNEDDS. Podejście to obejmowało warstwę SNEDDS bez RMP, która była oddzielona od warstwy RMP przez warstwę ochronną. Unikalną zaletą tego podejścia jest izolowanie RMP od lipidowych substancji pomocniczych SNEDDS, potencjalnie zwiększając stabilność leku podczas przechowywania. Godny uwagi potencjał ramiprilu do degradacji na wiele zanieczyszczeń podkreśla konieczność posiadania dokładnych i specyficznych metod analitycznych, które mogą wiarygodnie ilościowo określić aktywny lek w obecności tych produktów degradacji. W obecnym badaniu, naukowcy opracowali metody UPLC i LC-MS/MS do dokładnego oznaczania ilościowego RMP i THQ w obecności ich zanieczyszczeń degradacyjnych w formulacji, wraz z ilościowym oznaczaniem RMP i jego aktywnego metabolitu (ramiprilatu) w osoczu. Osiągnięcie to stanowi kluczowy kamień milowy w kierunku precyzyjnego oznaczania ilościowego leków podczas charakterystyki in vitro i in vivo.

Zrozumienie farmakokinetyki ramiprilu, w tym jego wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania, jest kluczowe dla oceny skuteczności formulacji. Dokładna ocena zarówno stabilności chemicznej, jak i farmakokinetyki może kierować produkcją optymalnych formulacji ramiprilu. Obecne badanie podejmuje rozwój RMP-SNEDDS, włączając BSO jako fazę olejową i wykorzystując techniki powlekania w złożu fluidalnym, z naciskiem na kompleksową ocenę stabilności chemicznej i farmakokinetycznej w modelach szczurzych.

Jakie metody stosowano przy opracowywaniu formulacji SNEDDS?

Ramipril (RMP) został pozyskany od Jai Radhe Sales (Ahmedabad, Indie), aktywny metabolit ramiprilu – ramiprilat oraz tymochinon (THQ) od Sigma‒Aldrich (St. Louis, MO, USA), a inne chemikalia uzyskano od następujących dostawców: Imwitor 988 (I988), Imwitor 308 (I308), Kolliphor EL (KrEL), Kolliphor ELP high purity (KrEL (HP), Kolliphor RH40 (Kr-RH40) i Kollicoat^® Smartseal 30 D od BASF, (Ludwigshafen, Niemcy), uwodorniony olej rycynowy (HCO30) od Nicole chemical co., (Tokio, Japonia), Tween 20 (T20) od BDH, Anglia, Tween 85 (T85) od Merck-Schuchardt OHG, Niemcy, Transcutol^® P (TCP) od Gattefossé (Lyon, Francja), Super refined Tween 80 (SR-T80) od CRODA (Düsseldorf, Niemcy), Vcaps Plus^® HPMC i kapsułki z żelatyny rybiej od Capsugel (Karolina Południowa, USA).

Nasiona Nigella sativa (znane również jako czarnuszka), ważące około 500 gramów, zostały zakupione w Kaligonj Bazar (Kaligonj, Gazipur, Bangladesz). Olej z czarnuszki (BSO) został następnie wyekstrahowany z nasion metodą tłoczenia na zimno w Masum Oil Mill. Wyekstrahowany olej był później przechowywany w szczelnie zamkniętej bursztynowej butelce do przyszłego użytku. Okaz dokumentacyjny (#15966) nasion Nigella sativa został wcześniej zdeponowany w Herbarium Wydziału Farmacji Uniwersytetu Króla Sauda w Arabii Saudyjskiej, a jego tożsamość została potwierdzona przez taksonomistę, dr. Mohammeda Yusufa, z Wydziału Farmacji Uniwersytetu Króla Sauda.

Tymochinon (2-izopropylo-5-metylobenzo-1, 4-chinon, THQ) jest jednym z głównych bioaktywnych składników N. sativa i został zatem użyty do standaryzacji BSO. Standardowy tymochinon (THQ) został zakupiony od Sigma‒Aldrich (St. Louis, MO, USA). Roztwór podstawowy THQ (500,0 μg/mL) został użyty jako roztwór referencyjny do standaryzacji BSO. Przygotowano seryjne stężenia THQ (0,5–50,0 μg/mL), a rzeczywistą ilość THQ w BSO obliczono na podstawie krzywej kalibracyjnej THQ. Ilość tymochinonu (THQ) obecnego w obecnie używanym oleju z czarnuszki wynosiła około 11,7 ± 1,2 mg/g, co jest zgodne z wcześniej zgłaszanymi ilościami THQ w BSO.

RMP-free płynne SNEDDS były początkowo przygotowywane przy użyciu bioaktywnego oleju (BSO) z niejonowym surfaktantem, współrozpuszczalnikiem i/lub współsurfaktantem w stosunku BSO/TCP/HCO-30 (32,25/27,75/40), jak opisano wcześniej. Powstałą mieszaninę energicznie homogenizowano (mieszano przez około 1 minutę) w celu osiągnięcia maksymalnej mieszalności. W przypadku SNEDDS załadowanych lekiem, RMP był ładowany do formulacji w stosunku 10 mg na gram w/w. Składniki były następnie dokładnie mieszane i sonikowane przez 1 godzinę, aby zapewnić całkowitą solubilizację leku i homogenizację. Przygotowane mieszaniny były finalnie przenoszone i przechowywane w probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 mL do dalszej charakterystyki.

Jednowarstowe samonanoemulsyfikujące pelety (Single-SNEPs) były przygotowywane za pomocą powlekarki fluidalnej z dyszą dolną (GPCC 1.1 fluid bed processor lab model, ACG Pharma Technologies Pvt. Ltd., Maharashtra, Indie), jak zilustrowano na Rysunku 2A i w Tabeli 1. Roztwór powlekający był precyzyjnie przygotowywany w trzech sekwencyjnych krokach. Najpierw przygotowano 20% wodny roztwór polimeru powlekającego. Następnie, świeżo przygotowane SNEDDS załadowane RMP i/lub środek przeciw sklejaniu były włączane do roztworu polimeru podczas mieszania mechanicznego. Trzecim krokiem było dodanie wody destylowanej w celu osiągnięcia pożądanego stężenia roztworu powlekającego. Wstępnie ogrzane nieparelowe sfery cukrowe były wprowadzane do komory złoża fluidalnego 10 minut przed powlekaniem. Następnie, roztwór powlekający był rozpylany na unoszące się sfery za pomocą pompy perystaltycznej. Finalnie, powlekane pelety były suszone przez minimum 10 minut.

Multi-SNEPs były przygotowywane za pomocą powlekarki fluidalnej z dyszą dolną (GPCC 1.1 fluid bed processor lab model; ACG Pharma Technologies Pvt. Ltd., Maharashtra, Indie), jak zilustrowano na Rysunku 2B i w Tabeli 1. Roztwór powlekający dla każdej warstwy był świeżo przygotowywany, mieszając odpowiednie składniki za pomocą mieszania mechanicznego. Ostateczna objętość była dostosowywana za pomocą niezbędnego roztworu obojętnego/zasadowego przy ciągłym mieszaniu. Dziesięć minut przed powlekaniem, sfery cukrowe (800–1000 µm) były wprowadzane do wstępnie ogrzanej komory złoża fluidalnego. Następnie, roztwór powlekający był rozpylany na unoszące się sfery za pomocą pompy perystaltycznej. Ogólnie, optymalne warunki operacyjne obejmowały wielkość partii (450–500), przepływ powietrza (45–55 cfm), ciśnienie powietrza atomizującego (1,2–2,5 bar), wysokość kolumny (25–40) i temperaturę produktu (23–38 °C). Po powlekaniu, pelety były suszone przez minimum 10 minut.

Proces powlekania w złożu fluidalnym miał na celu wytworzenie wielowarstwowych pelet, w których warstwa SNEDDS bez leku była chroniona przed RMP przez warstwę ochronną (Rysunek 2B, Tabela 1). Opcjonalnie, warstwy uszczelniające przed wilgocią i warstwy przeciw przywieraniu były nakładane w celu zabezpieczenia przed hydrolizą leku i przywieraniem pelet podczas przechowywania (Rysunek 2B, Tabela 1). W konsekwencji, różne wielowarstwowe pelety były przygotowywane poprzez zmianę liczby i składu warstw powlekających.

Formulacja dla warstwy SNEDDS bez leku podążała za udoskonalonym protokołem dla stałych lipidowych samonanoemulsyfikujących pelet ramiprilu (Single-SNEPs), ale bez RMP (Tabela 1). Optymalny roztwór powlekający składał się z płynnego SNEDDS:HPMC E3:Plasacryl T20 w stosunkach 40/54,5/5,5, osiągając całkowite stężenie 10%. Warstwa ochronna była konstruowana przy użyciu HPMC E3 w stężeniu 5%, mając na celu zrównoważenie integralności strukturalnej i przepuszczalności. Poprzez systematyczne eksperymenty, stężenie było dostrajane, aby zapewnić skuteczną ochronę przy jednoczesnym ułatwieniu pożądanej kinetyki uwalniania. Dla warstwy leku, roztwór powlekający był przygotowywany zgodnie z metodologią Sun i in. (2008), używając HPMC E3 w stosunku polimer/lek (4/1) i całkowitym stężeniu 3,5% przy pH 8.

Dodatkowe warstwy uszczelniające przed wilgocią i przeciw przywieraniu były również formowane, aby chronić RMP przed ekspozycją na wilgoć i aglomeracją pelet. Kollicoat^® Smartseal 30D został wybrany do ochrony RMP przed ekspozycją na wilgoć, z dokładnie ustawionym całkowitym stężeniem 15%. To podejście ma na celu zwiększenie stabilności i okresu przydatności do użycia, chroniąc skuteczność terapeutyczną i jakość. Na podstawie spostrzeżeń Kablitz i in. (2006), powlekane pelety były sucho mieszane z dwutlenkiem krzemu w 1% w/w, aby złagodzić aglomerację pelet podczas przechowywania.

Jak oceniano właściwości fizykochemiczne i stabilność preparatów?

Badania te przeprowadzono w celu oceny wydajności rozpuszczania zoptymalizowanych formulacji L-SNEDDS, Single-SNEPs i Multi-SNEPs. Testy rozpuszczania przeprowadzono przy użyciu aparatu do rozpuszczania USP II (Model: UDT-804, LOGAN Inst. Corp., USA) wyposażonego w mieszadło łopatkowe pracujące z prędkością 50 rpm. Medium rozpuszczające składało się z symulowanego soku żołądkowego (500 mL), 0,1M HCL bez enzymów, utrzymywanego w temperaturze 37 ± 0,5 °C. Próbki pobierano w odstępach 5, 10, 15, 30, 45 i 60 minut, a następnie filtrowano za pomocą strzykawki z filtrem. Przefiltrowane próbki były następnie odpowiednio rozcieńczane w rozpuszczalniku i analizowane przy użyciu zwalidowanej metody UPLC. Profile rozpuszczania oceniano pod względem wydajności rozpuszczania (DE%).

Stabilność chemiczna i fizyczna L-SNEDDS, Single-SNEPs i Multi-SNEPs była oceniana w przyspieszonych warunkach przechowywania. Zarówno płynne SNEDDS, jak i stałe SNEPs (pakowane w hermetyczne bursztynowe fiolki szklane) były poddawane przechowywaniu w komorach stabilności klimatycznej (Walk-in Chamber, Thermolab, Indie) utrzymywanych w temperaturze 40 °C ± 2 °C i wilgotności względnej (RH) 75% ± 5%. Próbki były pobierane po minimum 2 i 6 miesiącach i doprowadzane do równowagi w temperaturze pokojowej przed przeprowadzeniem wymaganych badań.

Stabilność chemiczna RMP i THQ była oceniana na podstawie procentu nienaruszonego leku pozostającego w formulacji. Próbki płynnego SNEDDS były bezpośrednio rozpuszczane w acetonitrylu i analizowane za pomocą UPLC. Podczas gdy stałe SNEPs były początkowo kruszone za pomocą młynka, następnie pobierano próbkę, rozpuszczano w acetonitrylu, sonikowano przez co najmniej 15 minut i analizowano za pomocą UPLC. Wszystkie oceny stabilności przeprowadzano w trzech powtórzeniach. Dodatkowo, wygląd fizyczny formulacji był wizualnie sprawdzany w celu odnotowania wszelkich zmian w mętności, kolorze lub aglomeracji pelet.

Próbki osocza były przetwarzane metodą wytrącania białek. Krótko mówiąc, 100 µL próbki osocza było łączone z 50 µL wewnętrznego standardu prednizolonu (50 µg/mL) i 3,5 mL metanolu, a następnie mieszane przez około 20 sekund. Po odwirowaniu przy 10 000 rpm przez 10 minut, 350 µL supernatantu przenoszono do probówki Eppendorfa i umieszczano pod wyciągiem do odparowania. Pozostałość rozpuszczano w 100 µL metanolu i sonikowano przez 5 minut, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie leku. Następnie próbki odwirowywano przez 10 minut, filtrat usuwano i umieszczano w wkładach do fiolek UPLC, a 5 µL wstrzykiwano do LC‒MS/MS do analizy ilościowej.

W tym badaniu zastosowano metodę UPLC‒MS/MS (UPLC: Waters Acquity, Milford, MA, USA) do obliczenia stężeń ramiprilu i ramiprilatu w osoczu szczurów. Metoda obejmowała użycie kolumny BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) z fazą ruchomą składającą się z acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego (50:50 v/v) w elucji izokratycznej przy przepływie 0,25 mL/min przez całkowity czas analizy 2 min. Prednizolon był stosowany jako wewnętrzny standard. Eluowane anality były wykrywane i oznaczane ilościowo za pomocą spektrometru masowego tandemowego (detektor TQ, Waters Corp., Milford, MA) wyposażonego w źródło jonizacji elektrorozpylania (ESI), które było obsługiwane w trybie jonizacji dodatniej. Oznaczanie ilościowe było wykonywane w trybie monitorowania wielu reakcji (MRM).

Microsoft Excel został użyty do obliczenia parametrów farmakokinetycznych z eksperymentów. Pole pod krzywą stężenia w osoczu w czasie (AUC) obliczono metodą trapezoidalną. Względną biodostępność reprezentatywnego SNEDDS w stosunku do kontroli obliczono w następujący sposób: względna biodostępność % = 100 * AUC_SNEDDS/AUC _kontrola. Maksymalne stężenie w osoczu (Cmax) i czas do osiągnięcia maksymalnego stężenia (Tmax) po podaniu doustnym określono bezpośrednio z krzywej stężenia w funkcji czasu.

Zestaw danych analizowano za pomocą Python 3.9.13 w środowisku Jupyter Notebook. Normalność oceniano za pomocą testu Shapiro‒Wilka, a jednorodność wariancji oceniano testem Levene’a. Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą bibliotek Python, w tym Scipy.stats, pingouin i statsmodels. Poziom istotności ustalono na wartość p mniejszą niż 0,05. W przypadku danych o rozkładzie normalnym i jednorodnych wariancjach, do porównania wielu średnich grup użyto jednoczynnikowej ANOVA z testem post hoc Tukeya. Gdy założenie jednorodności zostało naruszone, przeprowadzono ANOVA Welcha, a następnie test post hoc Gamesa–Howella. W przypadku danych o nienormalnym rozkładzie, test Kruskala‒Wallisa, a następnie test post hoc Dunna, został zastosowany do oceny różnic w medianach między grupami. Niektóre części tekstu manuskryptu zostały skomponowane i/lub udoskonalone przy pomocy Claude AIbot (Anthropic/Poe). Niemniej jednak, autorzy zachowali pełną odpowiedzialność za ogólną konceptualizację i ustalenia.

Czy wyniki badań in vitro i in vivo potwierdzają skuteczność SNEDDS?

Analiza mikroskopowa jednowarstowych (Single-SNEPs) i wielowarstwowych (Multi-SNEPs) samonanoemulsyfikujących pelet ujawniła ich integralność strukturalną i charakterystykę morfologiczną. Zarówno Single-SNEPs, jak i Multi-SNEPs wykazywały kształty sferyczne z gładkimi powierzchniami, wskazujące na jednolite powlekanie i enkapsulację. Pelety wykazywały dobrze zdefiniowane granice, sugerujące dokładne i spójne powlekanie płynnego SNEDDS w matrycy polimerowej. Co godne uwagi, pelety wykazywały zestalony wygląd, wskazujący na udane powlekanie w złożu fluidalnym i późniejsze zestalenie enkapsulowanego SNEDDS.

Profile rozpuszczania wszystkich formulacji SNEDDS, w tym L-SNEDDS, Single-SNEPs i 5L-SNEPs, nie różniły się znacząco od czystego RMP (p > 0,05). Co godne uwagi, wśród tych formulacji, 5L-SNEPs wykazały najwyższy procent wydajności rozpuszczania (DE%) dla RMP. To odkrycie sugeruje, że wielowarstwowa struktura 5L-SNEPs mogła zwiększyć uwalnianie RMP, skutkując poprawionymi charakterystykami rozpuszczania leku. Graficzną reprezentację tych wyników można znaleźć na Rysunku 3A i jego odpowiednim szczególe, Rysunku 3A.

Wydajność rozpuszczania (DE) wszystkich formulacji SNEDDS, a mianowicie L-SNEDDS, Single-SNEPs i 5L-SNEPs, była znacząco większa (p < 0,05) niż czystego THQ (Rysunek 4A i jego szczegółowy widok, Rysunek 4A). Co godne uwagi, wśród tych formulacji, 5L-SNEPs wykazały najbardziej zauważalną poprawę w THQ DE%, przewyższając czysty THQ czterokrotnym wzrostem DE%. Ten znaczący wzrost podkreśla skuteczność wielowarstwowej struktury 5L-SNEPs w ułatwianiu uwalniania THQ, podkreślając jej potencjał jako obiecującej formulacji dla ulepszonego dostarczania leków.

RMP wykazał znaczną degradację we wszystkich formulacjach, co było widoczne zarówno w próbkach 2-miesięcznych, jak i 6-miesięcznych (Rysunek 5). Do 6-miesięcznego punktu czasu, całkowita degradacja RMP nastąpiła w L-SNEDDS, Single-SNEPs, a nawet 3L-SNEPs. W wyraźnym kontraście, 4L-SNEPs i 5L-SNEPs znacząco zwiększyły stabilność RMP, z poprawą odpowiednio o 30% i 37% w porównaniu z innymi formulacjami. Godne uwagi jest, że włączenie dwutlenku krzemu do Multi-SNEPs wykazało korzystny efekt stabilizacyjny na RMP w formulacji, dodatkowo zwiększając jego stabilność. Te odkrycia podkreślają potencjał warstwy uszczelniającej przed wilgocią i warstwy przeciw przywieraniu w poprawie stabilności formulacji zawierających RMP podczas przechowywania.

Chociaż dane nie były zbierane w punkcie czasowym 4 miesiące, wzorzec degradacji obserwowany między punktami czasowymi 2 miesiące i 6 miesięcy dla formulacji 5L-SNEP sugeruje spójną redukcję około 20% nienaruszonego RMP co dwa miesiące w przyspieszonych warunkach przechowywania dla tej konkretnej formulacji. Obserwowany trend w danych stabilności wspiera hipotezę o potencjalnej liniowej redukcji stabilności RMP, w 5L-SNEPs, w czasie.

W porównaniu z RMP, THQ miał lepszy profil stabilności we wszystkich formulacjach (Rysunek 6). W przeciwieństwie do RMP, płynny SNEDDS utrzymywał najwyższy nienaruszone THQ, ze znaczącą (p < 0,05) różnicą w porównaniu z większością innych formulacji. Pod koniec badania, L-SNEDDS utrzymywał 70% nienaruszonego THQ w formulacji.

Pod koniec badania, wygląd fizyczny płynnego SNEDDS nie zmienił się (Tabela S1, Rysunek 7A). Single-SNEPs wykazały znaczącą aglomerację pelet i przywieranie do ściany pojemnika, jak pokazano na Rysunku 7B. Ani RMP-free Single-SNEPs, ani 3L-SNEPs nie zmieniły znacząco wyglądu pelet (Rysunek 7C i D). Co interesujące, 4L-SNEPs wykazały znaczącą aglomerację pelet i przywieranie do ściany pojemnika, co było odwracalnie deaglomerowane przez szpatułkę (Rysunek 7E). W przeciwieństwie do tego, 5L-SNEPs utrzymywały dobrą płynność pelet aż do końca badania (Rysunek 7F). Te odkrycia ujawniają korzystny efekt dodania dwutlenku krzemu jako warstwy przeciw przywieraniu na wierzchu pelet.

Optymalne parametry jonizacji były następujące: Ramipril: pary jonizacji (m/z) 417,09→234,4 (napięcie stożka 40 V, energia kolizji 20 V) (Rysunek 8A); Ramiprilat: 389,25→206,06 (napięcie stożka 34 V, energia kolizji 52 V) (Rysunek 8B); i prednizolon: 403,09→220,35 (napięcie stożka 42 V, energia kolizji 13 V) (Rysunek 8C). Oceniono kilka kombinacji acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego jako możliwe fazy ruchome. Kombinacja acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego w izokratycznym programie elucji (50:50 v/v) okazała się najbardziej odpowiednia do rozdzielenia pików ramiprilu, ramiprilatu i wewnętrznego standardu prednizolonu. W opisanych warunkach chromatograficznych, czasy retencji wynosiły około 0,61, 0,57 i 0,56 min odpowiednio dla ramiprilu, ramiprilatu i prednizolonu (Rysunek S1).

Dobrą liniowość (r2>0,999) zaobserwowano dla ramiprilu w zakresie 10–500 ng/mL i dla ramiprilatu w zakresie 20–1000 ng/mL w ilości próbki tak małej jak 50 µL osocza szczura, co można opisać następującymi równaniami regresji: Y = 0,0571x + 0,4815 (Ramipril, Rysunek S2) i Y = 0,0052x + 0,9755 (ramiprilat, Rysunek S2), gdzie Y było stosunkiem pola powierzchni leku do wewnętrznego standardu, a X było stężeniem analitu w ng/mL w osoczu.

Badanie farmakokinetyczne obejmowało cztery formulacje: płynny SNEDDS, wielowarstwowe SNEPs (Multi-SNEPs), tabletki RMP dostępne na rynku i czysty RMP. AUC (ng/h/mL) odzwierciedla całkowitą ekspozycję, Cmax (ng/mL) jest szczytowym stężeniem w osoczu, a Tmax (h) jest czasem do osiągnięcia Cmax. Badanie farmakokinetyki płynnych SNEDDSs [BSO/TCP/HCO-30] wykazało znaczące zwiększenie biodostępności leku, jak zilustrowano w Tabeli 2 i na Rysunku 9.

W kontekście surowego proszku RMP podawanego doustnie, maksymalne stężenie (Cmax) zmierzono na poziomie 90 ng/mL, z odpowiadającym czasem do osiągnięcia maksymalnego stężenia (Tmax) wynoszącym 0,5 godziny. W przeciwieństwie do tego, gdy reprezentatywne płynne SNEDDSs RMP były podawane doustnie, Cmax znacznie się poprawił do 105,5 ng/mL (p > 0,05), a Tmax wynosił 0,8 godziny (p > 0,05). Z drugiej strony, Multi-SNEPs wykazały znaczny spadek Cmax do 59,5 ng/mL, a Tmax wynosił 0,6 godziny.

Ponadto, pole pod krzywą stężenie-czas od czasu zero do ostatniego mierzalnego stężenia (AUC0–t) RMP było znacznie większe w grupie płynnej SNEDDS niż w grupie leczonej proszkiem RMP (147%, P > 0,05). W szczególności, AUC0–t wzrosło z 307,6 ± 212,7 ng h/mL do 454,2 ± 264,9 ng h/mL. Ten wzrost względnej biodostępności dla RMP był również zgodny z tym dla tabletki RMP-Sandoz dostępnej na rynku. W przeciwieństwie do tego, w porównaniu z czystym RMP, Multi-SNEPs znacznie zmniejszyły AUC do 155 ng/mL, co było około 50% redukcją AUC (p > 0,05).

Obserwowane nakładające się wartości ± raportowane dla parametrów farmakokinetycznych mogą być przypisane nieodłącznej zmienności biologicznej między poszczególnymi osobnikami, małej wielkości próby i/lub potencjalnej heterogeniczności w populacji badanej. Ta zmienność mogła wpłynąć na jasność wniosków statystycznych i zdolność do wiarygodnego wykrywania różnic między formulacjami.

Rozwój stabilnych i biodostępnych formulacji RMP, szeroko przepisywanego inhibitora ACE, ma znaczące znaczenie kliniczne w leczeniu nadciśnienia i niewydolności serca zastoinowej. Nieodłączna niestabilność chemiczna ramiprilu, która może prowadzić do zmniejszonej skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa, podkreśla potrzebę innowacyjnych strategii formulacyjnych, aby chronić lek, dopóki nie zostanie wchłonięty i przekształcony w organizmie.

Obecne badanie podjęło kompleksową ocenę płynnych i stałych samonanoemulsyfikujących systemów dostarczania leków (SNEDDS) dla ramiprilu, włączając kardioprotektywny olej z czarnuszki (BSO) jako fazę olejową. Badacze wykorzystali techniki powlekania w złożu fluidalnym do przekształcenia płynnych SNEDDS zarówno w jednowarstowe (Single-SNEPs), jak i wielowarstwowe (Multi-SNEPs) samonanoemulsyfikujące pelety, z naciskiem na ocenę stabilności chemicznej formulacji i profili farmakokinetycznych.

Proces powlekania w złożu fluidalnym skutecznie przekształcił płynne SNEDDS zarówno w Single-SNEPs, jak i Multi-SNEPs, co potwierdzono sferycznym kształtem i akceptowalnymi charakterystykami morfologicznymi pelet. Zestalony wygląd pelet sugerował, że płynny SNEDDS został skutecznie przekształcony w stan zestalony poprzez technikę powlekania w złożu fluidalnym.

Badania rozpuszczania in vitro wykazały, że wielowarstwowe 5L-SNEPs wykazały najwyższy procent wydajności rozpuszczania (DE%) zarówno dla ramiprilu, jak i włączonego bioaktywnego związku, tymochinonu. To odkrycie sugeruje, że wielowarstwowa struktura może skutecznie poprawić uwalnianie i rozpuszczanie tych aktywnych składników.

Przyspieszone badanie stabilności ujawniło krytyczną różnicę w stabilności chemicznej ramiprilu w różnych formulacjach. Podczas gdy grupy L-SNEDDS, Single-SNEP i 3L-SNEP wykazały całkowitą degradację ramiprilu do 6-miesięcznego punktu czasowego, formulacje 4L-SNEPs i 5L-SNEPs znacząco poprawiły stabilność ramiprilu, z odpowiednio 30% i 37% nienaruszonego ramiprilu pozostającego. Ta zwiększona stabilność osiągnięta z wielowarstwowymi formulacjami SNEP może być przypisana włączeniu warstw uszczelniających przed wilgocią i dwutlenku krzemu, które skutecznie chroniły lek przed mechanizmami degradacji, takimi jak hydroliza.

W przypadku THQ, związek wykazał lepszą stabilność niż RMP we wszystkich formulacjach. Godne uwagi jest, że płynny SNEDDS utrzymywał najwyższy nienaruszone THQ, ze znaczącą różnicą w porównaniu z większością innych formulacji. Pod koniec badania, L-SNEDDS zachował 70% nienaruszonego THQ w formulacji.

Ocena stabilności fizycznej ujawniła, że 5L-SNEPs utrzymywały dobrą płynność pelet aż do końca badania, wskazując na korzystny efekt warstwy przeciw przywieraniu z dwutlenku krzemu dodanej na wierzch pelet.

Te dane pokazują, że poprzez staranne wybieranie takich ochronnych polimerów, degradacja wrażliwych leków, takich jak RMP, może być dodatkowo zminimalizowana. W szczególności, użycie wielofunkcyjnych polimerów maskujących smak i chroniących przed wilgocią, takich jak Kollicoat Smartseal, dodatkowo zwiększyło wydajność powlekanych pelet. Poprzez dostrajanie parametrów przetwarzania opisanych powyżej, można osiągnąć pożądane poziomy powlekania z maksymalnym ładowaniem leku i poprawioną stabilnością leków wysoce wrażliwych na wilgoć, takich jak RMP. Łącznie, wyniki tego badania otwierają drogi dla kilku innych leków, które są nierozpuszczalne, wrażliwe na wilgoć i wysoce gorzkie. Użycie innowacyjnych polimerów, takich jak Kollicoat Smartseal, może pomóc zwiększyć stabilność API, działając jako bariera wilgoci, aby zapobiec hydrolizie lub degradacji.

Badanie farmakokinetyczne u szczurów dostarczyło ważnych spostrzeżeń dotyczących wydajności in vivo różnych formulacji ramiprilu (RMP). Podczas gdy grupa płynnego SNEDDS prezentowała liczbowo większe Cmax (105,5 ng/mL) i AUC (454,2 ng·h/mL) z 1,5-krotnym wzrostem AUC w porównaniu z grupą surowego proszku RMP (AUC: 307,6 ng·h/mL), różnice te nie były statystycznie istotne. Co ciekawe, wielowarstwowa formulacja 5L-SNEPs, która wykazała najwyższą wydajność rozpuszczania in vitro dla RMP, nie wykazała większej biodostępności in vivo niż surowy proszek RMP. W rzeczywistości, 5L-SNEPs prezentowały niższe Cmax (59,5 ng/mL) i AUC (155,1 ng·h/mL) niż proszek RMP. Jednakże, analiza statystyczna nie wykazała znaczących różnic między żadną z formulacji dla parametrów AUC, Cmax i Tmax. Wysoka zmienność w danych, jak widać z dużych wartości odchylenia standardowego, mogła przyczynić się do braku znaczących różnic między formulacjami. Dlatego, podczas gdy liczbowo, płynny SNEDDS wykazał większą ekspozycję, wysoka zmienność międzyosobnicza maskowała statystyczną istotność tej różnicy w porównaniu z innymi grupami.

Można zasugerować kilka czynników, aby przewidzieć rozbieżność między lepszym rozpuszczaniem in vitro a niższą ekspozycją in vivo Multi-SNEPs niż czystego leku: Trawienie i Wchłanianie: Testy in vitro nie uwzględniają złożonej dynamiki trawiennej przewodu pokarmowego. Czynniki takie jak emulsyfikacja, trawienie substancji pomocniczych, wytrącanie leków z nanoemulsji i interakcje z transporterami jelitowymi wpływają na wchłanianie in vivo, ale nie są odzwierciedlone w prostych testach rozpuszczania. Efekty Substancji Pomocniczych: Niektóre substancje pomocnicze w Multi-SNEPs mogą negatywnie oddziaływać z transporterami jelitowymi i zmniejszać przenikanie, efekt nieobserwowany in vitro.

W związku z tym, dalsza optymalizacja jest potrzebna, aby zniwelować różnicę między ulepszonymi charakterystykami in vitro a wydajnością in vivo multi-SNEPs. Obejmuje to: Badanie wpływu zmiany polimerów używanych do zestalania SNEDDS, nakładania warstwy leku, uszczelniania przed wilgocią i/lub warstw przeciw przywieraniu na wydajność in vivo Multi-SNEPs. Może to pomóc zidentyfikować najbardziej odpowiednie substancje pomocnicze do poprawy wchłaniania in vivo i zachowania farmakokinetycznego RMP. Ocenę wpływu zmiany kolejności i liczby warstw powlekających w Multi-SNEPs na profil farmakokinetyczny in vivo. Może to dostarczyć więcej spostrzeżeń na temat optymalnej struktury wielowarstwowej, która może zwiększyć biodostępność RMP. Włączenie pojedynczych SNEPs załadowanych lekiem do badania in vivo, aby porównać ich wydajność in vivo z 5L-SNEPs. Może to pomóc wyjaśnić, czy izolacja między RMP a warstwą SNEDDS w Multi-SNEP stwarza jakiekolwiek wyzwania in vivo, które mogą hamować migrację leku do utworzonych kropli nanoemulsji.

Obserwowana poprawa biodostępności RMP z płynnego SNEDDS mogła być przypisana poprawionym profilom rozpuszczalności i rozpuszczania leku. Płynny SNEDDS mógł ułatwić lepsze pobieranie nanoemulsji przez enterocyty w miejscu wchłaniania, jak zaproponowali Elgart, Cherniakov i in. (2013). To odkrycie jest zgodne z wcześniejszymi raportami wspierającymi pojęcie poprawionej biodostępności poprzez zwiększoną rozpuszczalność i wchłanianie, jak udokumentowano w poprzednich publikacjach.

W tym badaniu, stosunek AUC płynnego SNEDDS do czystego RMP wynosił 1,47, sugerując, że biodostępność płynnego SNEDDS była około 47% większa niż czystego leku, chociaż różnica nie była statystycznie istotna. Ogólnie, brak znaczącej poprawy ekspozycji z formulacji SNEDDS mógł być przypisany wysokiej zmienności, złożonej wydajności in vivo systemów na bazie lipidów i/lub zależności od procesu trawienia. Wyniki farmakokinetyczne podkreślają potrzebę starannej oceny wydajności in vivo zestalonych formulacji SNEDDS, ponieważ dodatkowe kroki przetwarzania i warstwy powlekające mogą nie zawsze przekładać się na poprawioną biodostępność, pomimo ulepszonych charakterystyk in vitro.

Podsumowanie

Badanie koncentrowało się na opracowaniu i ocenie samonanoemulsyfikujących systemów dostarczania leków (SNEDDS) dla ramiprilu, wykorzystując olej z czarnuszki jako fazę olejową. Zastosowano techniki powlekania w złożu fluidalnym do wytworzenia zarówno jednowarstowych, jak i wielowarstwowych pelet. Wielowarstwowe pelety 5L-SNEPs wykazały najwyższą wydajność rozpuszczania dla ramiprilu i tymochinonu, a także znaczącą poprawę stabilności ramiprilu, zachowując 37% nienaruszonego leku po 6 miesiącach przechowywania. Płynny SNEDDS wykazał numerycznie większą biodostępność (47% wzrost AUC) w porównaniu z czystym ramiprilem, choć różnica nie była statystycznie istotna. Badania farmakokinetyczne ujawniły potrzebę dalszej optymalizacji formulacji wielowarstwowych, gdyż pomimo dobrych wyników in vitro, nie przełożyły się one na zwiększoną biodostępność in vivo. Wyniki wskazują na potencjał systemu SNEDDS w poprawie stabilności i potencjalnie biodostępności ramiprilu, choć konieczne są dalsze badania nad optymalizacją formulacji.